紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)來(lái)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。同時(shí)也是一種是涵蓋臨床檢驗(yàn)在內(nèi)的價(jià)廉、快速、高靈敏度的常用定量分析方法之一。利用被測(cè)物質(zhì)對(duì)光的吸收特征和吸收強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種分析方法，是在比色的基礎(chǔ)上所發(fā)展起來(lái)的。紫外-可見(jiàn)分光光度法廣泛用于金屬、合金、鋼鐵、化工產(chǎn)品、生物材料、食品、臨床和環(huán)境樣品以及藥物中微量無(wú)機(jī)物和有機(jī)物的測(cè)定。

【資料圖】

描述物質(zhì)分子對(duì)輻射的吸收程度隨波長(zhǎng)變化的函數(shù)關(guān)系曲線即為吸收光譜，物質(zhì)的吸收光譜具有與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征性。當(dāng)光穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度隨光的波長(zhǎng)不同而變化，因此能夠通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在不同波長(zhǎng)處的吸光度，來(lái)繪制其吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系圖即得被測(cè)物質(zhì)的吸收光譜。

從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長(zhǎng)λ_max和最小吸收波長(zhǎng)λ_min，隨后即可通過(guò)特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)樣品的光譜與對(duì)照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過(guò)確定最大吸收波長(zhǎng)，或通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)特定波長(zhǎng)處的吸光度比值而鑒別物質(zhì)。在用于定量時(shí)，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對(duì)照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。

以下是在使用紫外-可見(jiàn)分光光度法時(shí)對(duì)溶劑、測(cè)定方以及儀器方面的要求及校正和檢定。

使用紫外-可見(jiàn)分光光度法時(shí)對(duì)溶劑的要求

1.當(dāng)有機(jī)溶劑含有雜原子時(shí)，通常具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，要將其當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(zhǎng)，例如甲醇、乙醇的截止使用波長(zhǎng)為205nm；

2.當(dāng)溶劑不純時(shí)，可能會(huì)增加干擾吸收。因此，在測(cè)定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白(即空白光路中不置任何物質(zhì))測(cè)定其吸光度；

3.溶劑和吸收池的吸光度要求在220～240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.10，在300nm以上時(shí)不得超過(guò)0.05。

測(cè)定時(shí)的注意事項(xiàng)

1.在測(cè)定時(shí)，通常需以配置供試品溶液的同批溶劑為空白對(duì)照，使用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長(zhǎng)±2nm以?xún)?nèi)測(cè)試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長(zhǎng)附近自動(dòng)掃描測(cè)定，以核對(duì)供試品的吸收峰波長(zhǎng)位置是否正確。并且吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±2nm以?xún)?nèi)，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜；

2.儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的1/10，否則測(cè)得的吸光度會(huì)偏低，因此選擇狹縫寬度的時(shí)候，應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增大為準(zhǔn)；

3.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，在測(cè)定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量；

4.當(dāng)溶液的pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響時(shí)，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對(duì)照品溶液的pH值調(diào)成一致。

測(cè)定法含量檢測(cè)一般有對(duì)照品比較法、吸收系數(shù)法、計(jì)算分光光度法以及比色法。

1.對(duì)照品比較法：按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定的波長(zhǎng)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度后，按下式計(jì)算供試品中被測(cè)溶液的濃度：c_x=(A_x/A_r)c_r。式中c_x為供試品溶液的濃度；A_x為供試品溶液的吸光度；c_r為對(duì)照品溶液的濃度；A_r為對(duì)照品溶液的吸光度。

2.吸收系數(shù)法：按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測(cè)定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。

3.計(jì)算分光光度法：計(jì)算分光光度法有多種，使用時(shí)應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。當(dāng)吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測(cè)定時(shí)，波長(zhǎng)的微小變化可能對(duì)測(cè)定結(jié)果造成顯著影響，故對(duì)照品和供試品的測(cè)試條件應(yīng)盡可能一致。計(jì)算分光光度法一般不宜用作含量測(cè)定。

4.比色法：供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收移至可見(jiàn)光區(qū)，這種測(cè)定方法稱(chēng)為比色法。用比色法測(cè)定時(shí)，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對(duì)照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一體積，顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。也可取對(duì)照品溶液與供試品溶液同時(shí)操作，顯色后，以相應(yīng)的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品和供試品溶液的吸光度，按對(duì)照品比較法計(jì)算供試品溶液的濃度。

使用紫外-可見(jiàn)分光光度法的儀器校正及檢定

1. 波長(zhǎng)：由于環(huán)境因素對(duì)機(jī)械部分的影響，儀器的波長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)，因此除應(yīng)定期對(duì)所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測(cè)定前校正測(cè)定波長(zhǎng)。儀器波長(zhǎng)的允許誤差為：紫外光區(qū)±lnm，500nm附近±2nm。

(1)常用汞燈中的較強(qiáng)譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；

(2)用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正；

(3)鈥玻璃在波長(zhǎng)279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長(zhǎng)校正用，需注意鈥玻璃會(huì)因來(lái)源不同或隨著時(shí)間的推移會(huì)有微小的變化；

(4)高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥(Ho2O3)4%的溶液，該溶液的吸收峰波長(zhǎng)為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

2.吸光度的準(zhǔn)確度：可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱(chēng)定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定并計(jì)算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。

3.雜散光的檢查：可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。

關(guān)鍵詞： 分光光度法 吸收系數(shù) 不得超過(guò)